Новый метод диагностики мочевого пузяря расскажет о проблемах за годы
Под руководством сотрудницы кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ и Международного агентства по исследованию рака команда исследователей из Франции, Бангладеша, Бразилии, Италии, Португалии и России сообщила о разработке нового ПЦР анализа для выявления рака мочевого пузыря.
Работа опубликована в журнале International Journal of Molecular Sciences и отмечена Международным обществом клинических уологов.
Новый метод позволяет быстро и надежно определять в моче наличие маркеров рака мочевого пузыря. Разработка представляет собой простой диагностический анализ мочи и отличается от стандартного метода диагностики высокой чувствительностью и неинвазивностью. Тест можно использовать, чтобы следить за прогрессом и рецидивами рака мочевого пузыря, и даже обнаружить его присутствие до проявления клинических симптомов.
«Эта разработка – часть большого проекта под эгидой Международного агентства по исследованию рака, которое относится к Всемирной организации здравоохранения, – рассказывает доктор химических наук, профессор, заместитель декана химического факультета МГУ по научной работе Мария Зверева. – Мне повезло работать в этом агентстве некоторое время, сейчас сотрудничество между МГУ и агентством также продолжается. Статья была в основном сделана, когда я была сотрудником агентства, а вернувшись, я продолжила это исследование на химическом факультете МГУ. Роль агентства состоит в том, чтобы максимально вовлечь и скоординировать исследования в области рака между разными странами. Врачи из разных стран участвовали в сборе образцов у пациентов, на основе этих образцов и были проведены исследования. Сравнение этих образцов важно из-за отличия геномов людей из разных стран. Поэтому для поиска универсального маркера очень важно скоординировать исследователей из разных стран»
Из-за высокой частоты рецидивов и стоимости методов диагностики выявление и лечение рака мочевого пузыря очень дороги. Сейчас для диагностики и мониторинга рака мочевого пузыря в качестве золотого стандарта применяют цистоскопию. Цистоскопия – это осмотр внутренней поверхности мочевого пузыря при помощи катетера с оптической и осветительной системами, вводимого через уретру. Инвазивность – это всегда риск осложнений и высокая стоимость. Для пациентов была бы предпочтительна замена этого вида диагностики на высокочувствительный специфический неинвазивный тест. Также применяется цитологическое исследование мочи, которое, однако, менее чувствительно, чем цистоскопия. Поэтому для лиц, находящихся под регулярным медицинским наблюдением и подозрением на данный вид рака, очень актуальна разработка чувствительного и неинвазивного теста с достаточной прогностической точностью.
«Сначала нужно было найти, что именно связано с молекулярными механизмами возникновения опухолевого процесса, – комментирует Мария Зверева. – Мутации, которые мы детектировали в этом исследовании, активирует синтез теломеразы в клетке. Известно, что каждая соматическая клетка нашего организма имеет строго ограниченный потенциал деления. То, сколько раз она поделится, определяется особыми структурами на концах генома – теломерами. Именно теломераза удлиняет, синтезирует компоненты теломерных структур на концах хромосом. В случае опухолевой клетки активация теломеразы происходит в более чем 90% всех типов рака. Это один из молекулярных организмов, взлом которого необходим для того, чтобы клетка превратилась в опухолевую. Активация теломеразы может происходить в том числе из-за мутации в промоторной области. В исследованиях ранее было показано, что в случае рака мочевого пузыря активация теломеразы происходит именно по механизму появления таких мутаций»
Обломки геномной ДНК удаляемых организмом опухолевых клеток попадают в биологические жидкости и выводятся организмом. Однако на фоне других фрагментов геномной ДНК, из обычных клеток, таких обломков ничтожно мало. Ранее считалось, что достоверно их определить невозможно. Именно это было ограничением для развития методов неинвазивной диагностики опухолевых процессов. С развитием технологий разработка таких подходов стала возможна.
Отличие ДНК клеток опухоли от нормальных клеток можно детектировать методом секвенирования нового поколения. Секвенирование нового поколения – это высокопроизводительное определение последовательности нуклеиновых кислот. Однако для использования в клинике оно пока не сертифицировано. «Секвенирование нового поколения в силу своей сложности и биоинформатического анализа пока что остается только исследовательским методом, – поясняет Мария Зверева. – А целью нашей работы было быстро пройти от фундаментального исследования именно до метода с возможностью внедрения в клинику».
В настоящей работе предлагается использование числового капельного ПЦР-теста как нового метода детектирования опухолевых ДНК в биологических жидкостях. ПЦР – циклический процесс с участием фермента ДНК-полимеразы (фермента, осуществляющего синтез ДНК), за счет которого одну молекулу можно скопировать в большом количестве и впоследствии детектировать. ПЦР-диагностика сейчас является одним из самых востребованных методов диагностики в клинике.
Числовая капельная ПЦР – это следующее поколение данного метода, объединяющее в себе как классический ПЦР, так и микрофлюидику. Реакционная смесь заключается в масло и выводится из реактора в виде капель. Условия этого процесса подобраны так, что при нагревании масляная капля превращается в пластиковую – своеобразную запаянную микропробирку, в которой проводят ПЦР. Так можно провести ПЦР не в одной пробирке, а в тысячах капель. Обычно таких капель делают от 10 до 20 тысяч для одного образца. Далее происходит анализ капель. По количеству сигналов можно посмотреть, что произошло в каждой капле. В результате получается 10 тысяч сигналов на 1 образец. Варьируя условия реакции, можно количественно считать исходные молекулы. Получается, что метод позволяет перейти на подсчет абсолютного количества ДНК в исходном образце, в то время как классический ПЦР в реальном времени таких данных получить не позволяет. Поэтому новый метод позволяет определить штучное количество молекул с определенной последовательностью на фоне 10 тысяч схожих молекул, при этом сигнал получается достоверным.
При сравнении результатов диагностики методом секвенирования нового поколения и числовым капельным ПЦР обнаружилось, что новый метод не только подтвердил результаты предыдущего анализа, но и в некоторых случаях даже превзошел его по клинической чувствительности. В целом же наблюдалось практически идеальное согласование результатов обоих анализов. При этом новый метод анализа отличается отсутствием необходимости объемной биоинформатической пост-обработки данных и позволяет быстро получить результат. Также приборная база ПЦР сертифицирована для клиники за рубежом, поэтому пройти путь от фундаментальных исследований до использования в качестве мирового диагностического стандарта возможно достаточно быстро.
Использование цифрового капельного ПЦР возможно в качестве предсказательного метода диагностики. Это было показано на раннем уникальном исследовании, при проведении которого в Иране был получен уникальный набор образцов. Десять тысяч здоровых на момент начала исследования человек каждый год сдавали образцы крови, мочи, слюны на протяжении десяти лет. Затем исследователи фиксировали, какие заболевания возникали у этих людей. Так появилась возможность «заглянуть в прошлое» на 10 лет назад и проверить предсказательную силу метода. Метод сигнализировал о начале развития заболевания за годы до первых симптомов.
«Если говорить о дальнейшем развитии исследования, необходимо продолжение клинических испытаний, подтверждение данных для нашей страны, – объясняет Мария Зверева. – И я уже сотрудничаю с МНОЦ МГУ, исследование началось и проходит под руководством директора клиники академика РАН Армаиса Альбертовича Камалова. Затем предстоит внедрение этого метода диагностики. Пока речь идет о сотнях протестированных образцов. Это уже может быть помощью в клинике. Чтобы метод был внесен в мировые стандарты, необходим сбор тысяч образцов из разных стран, с разными условиями. Но уже в наших предыдущих работах Европейскому обществу урологов была выдана рекомендация рассмотреть этот метод с тем, чтобы внести его в клинические стандарты».
